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主要内容
RT-PCR原理
RT-PCR步骤
常见问题分析
两步法RT-PCR
一步法RT-PCR
两步法与一步法RT-PCR比较
RT-PCR主要用途
分析基因的转录水平
获取目的基因
合成cDNA探针
逆转录酶的选择
AMV：
禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃ （Bioflux公司）。
MMLV：
Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛）
Super RNaseH- Reverse Transcriptase
MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）
RNase H的作用
水解RNA-DNA杂合链中的RNA
RT-PCR引物的选择
随机引物：
 适用于长的或具有发卡 结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。
Oligo(dT15-18)：
适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。
特异性引物：
与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。
提高RT-PCR灵敏度
1.分离高质量RNA
2.使用无RNaseH活性的逆转录酶
3.提高逆转录酶保温温度
4.减少基因组DNA污染
RT常见问题
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Invitrogen RT-PCR 新工具