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RT-PCR引物的选择
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2007-04-05|  字体: [ ]  

随机引物

适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

Oligo dT

适用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。

基因特异性引物

与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的SuperScript One-Step System特别适合于与基因特异性 引物连用。

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异

性扩增带与非特异性扩增带。

原因

建议

引物

引物特异性差

重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强其特异性或使用巢式PCR

引物浓度过高

适当减少引物浓度

Mg2 浓度

Mg2 浓度过高

适当降低Mg2 浓度,从1mM3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。

耐热聚合酶

酶量过多


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