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| [ 文章来源： | 文章作者：
| 发布时间：2007-04-05|
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材料：
（1）急性期病人血清、鼠肺、鼠血或分离的汉坦病毒
（2）引物：
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引物
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序列（5’～3’）
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位置
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片段（bp）
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逆转录引物
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TAGTAGTAGACTCC
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1~14
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LMS
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通用外引物
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AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG
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1910~1939
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M( )
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GTACAICCTGTRCCIACCCC
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2373~2354
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M(-)
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型特异性引物
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汉滩病毒
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GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC
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1958~1984
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M( )
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GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC
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2318~2340
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M(－)
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汉城病毒
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GTGGACTCTTCTTCTCATTATT
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1936~1957
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M( )
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TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG
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2331~2353
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M(－)
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S片段引物
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ATGTTGCCTGGGGIAAAGAGG
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1200~1220
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S( )
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GCGCACTAGTAGTAGTAGACTCCCTAAAGA
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1670~1696
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S(-)
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方法：
（1）病毒RNA的提取：采用TRIzol按说明提取，制备模板RNA；
（2）逆转录、合成cDNA：采用SuperScripTMII或AMV逆转录酶，按说明书进行；
（3）PCR扩增：反应条件为95℃预变性10分钟，94℃60秒、55℃60秒、72℃45秒、扩增30～35个循环，72℃延伸12分钟。
（4）扩增产物用1～2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。若条带的分子量与预期片段大小相同，则表明为特异性扩增产物。
必要时，可进行：
（5）PCR片段的回收和核苷酸序列测定：切下特异分子量条带，用QIAquick凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序。
意义：扩增到特异性条带可确诊汉坦病毒并明确其型别，序列测定还可以对汉坦病毒的变异情况进行研究。
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RT-PCR实验方法大全