实验设计
为了绘制沙门氏菌的生长曲线，在盛有80 ml BHI培养基的250-ml摇瓶中接种2ml过夜培养产物(最终OD₆₀₀＝0.065)。每个管做3份平行，并置于37°C摇瓶培养(100 rpm)，按不同的时间间隔测量样品的OD₆₀₀以及活细胞计数（克隆计数）。核酸提取中，0.2到1ml的液体培养基(最多10⁹个细菌细胞)被转入1.5ml反应管；RNA样品则被均匀分散到2倍体积的RNA保护剂(QIAGEN)中，室温放置5min以稳定细菌RNA (1)，再经13,000×g离心10min，取上清冻存于－20°C备用。另外，在新鲜的BHI培养基中加入沙门氏菌的过夜培养产物，经4.5 h生长后(37°C, 100 rpm, 最终OD₆₀₀＝1.7)，3,000×g离心10min后把沉淀悬浮于0.25×Ringer 溶液(Oxoid)中，OD₆₀₀被调整到0.2以使得每毫升培养液约含10⁸个细胞。把1毫升上述培养物加入100 ml自来水或本研究院鱼池水中(每毫升培养液约含10⁶个细胞)，再把样品转入含90ml相应水样的瓶中，使菌密度为每毫升1－106个细胞。
结果分析
通过设计沙门氏菌invA和16S rRNA基因对应的特异引物，并采用Q-PCR和Q-RT-PCR方法对新的DNA和RNA参照进行了评价(Table 1)。每组样本都呈现出良好的线性标准曲线，相关系数(R²)可达到≥0.995，针对invA的线性范围达8个数量级，对16SrRNA则达7个数量级(Fig. 1)。在检出极限上，invA可达2个拷贝，16S rRNA则为1,000拷贝(Table 2)。反应效率值居于0.8和1.0之间(Table 2)。再经熔解曲线分析发现，每轮Q-PCR显示出很清晰的熔解曲线峰，而没有其他的非特异产物。

采用纯培养物确证实验方法
首先对培养的菌体进行5天的监控，接种后30 min便进入了对数生长期，这个时期会一直持续2.5h。3天后，CFU数目开始减少(Fig. 2A)。不同时间点取样并制备核酸样品，再通过Q-PCR和Q-RT-PCR分别对invA和16S rRNA的基因及其转录产物(RNAs)进行定量。在对数增长期，每CFU所对应16S rRNA和invA的基因拷贝数出现了增加（如接种后1.1 h），这是由染色体复制引起的(Fig. 2B)。接着，对应invA和16S rRNA每CFU拷贝数分别降低到1拷贝和5－10拷贝。这个结果印证了invA在沙门氏菌属中是单拷贝基因，它们有7个rrn操纵子(11)。试验中，16S rRNA和invA基因的比例大致恒定，一个invA对应8个16S rRNA拷贝(Fig. 2C)，这和预期值是一致的。RNA拷贝数则从接种后的2×10⁴增加到对数期的最大值5×10⁵(Fig. 2D)。随后，16S rRNA的拷贝数又会降低到刚接种状态。毒素基因invA在早对数期也有表达(最大值可达10 RNA拷贝/CFU; Fig. 2D)。

采用接种沙门氏菌的水样评估实验方法
对接种1－10⁶/ml沙门氏菌的饮用水和池塘水样进行分析，发现对于invA和16S rRNA每CFU具备相同的DNA拷贝数(Fig. 3A and B)。细胞数目越少，越容易出现偏差，表明随着污染物水平的降低这一方法的精确度会降低。invA和16S rRNA每CFU的基因拷贝数对于饮用水分别为0.69和2.9，对于池塘水则分别为0.74和 5.8。当水中接种104到106细胞时，饮用水和池塘水样对应的16S RNA表达很相似(Fig. 3C)。然而，较低的接种数目显示饮用水样中16S RNA表达低。综合来说，每CFU对应16S rRNA的RNA拷贝数在饮用水和池塘水中分别为2.6×104和4.2×10⁴。1拷贝inv基因对应16S rRNA的平均拷贝数在饮用水和池塘水样中分别为5×10⁴和5.5×10⁴。对于未接种的对照水样，invA没有扩增信号，而16S rRNA (RNA 和 DNA)却显示出具1 CFU/ml水样同样背景值

实验结果与讨论
Q-PCR是环境水样细菌检出和定量检测的新型方法(16,19)。定量方法建立在确定基因拷贝数的基础上，我们常采用基因组DNA来做标准品。但是，对于目的基因转录产物的定量这种方法便不可行了。在真核细胞中，我们可选取稳定表达的看家基因避免上述问题(3)。可是，细菌中并不存在这种稳定表达的看家基因。于是，我们发明了一种以Q-PCR为基础的定量方法，它不仅可以对细菌DNA精确定量，还可对环境水样中缺乏稳定表达看家基因的样本的RNA进行定量。据了解，这是首次成功的对原核细胞RNA进行定量。针对硅藻和海面植物的rbcL和rbcL基因的mRNA，我们也采用同样的方法用RNA标准品对其定量(25)。体外转录RNA被用做竞争性的RT-PCR的参照(29)。然而，采用随机引物容易造成RNA拷贝数的估测过高，原因是合成的短cDNA标准品缺乏引物结合位点。如果在Q-PCR过程中使用上述类似的引物合成DNA和RNA，也会出现相同的问题。虽然上述结果也可以用作Q-PCR的分析，但Q-RT-PCR过程中标准品的高估会造成对模板RNA拷贝数的估测高出实际值，这便使得此方法无法达到精确定量的要求。这是由于cDNA片断末端的不完整，和特异性引物结合位点缺失所造成的。为了避免上述问题，我们采用另一套引物用于RNA标准品的制备，这种引物扩增的片段比Q-PCR中得出的片段长(Table 1; Fig. 1)。其中，末端重叠是非常关键的，这使得合成cDNA的过程中的随机引物可得到延伸。另一个要考虑的问题是，DNase处理后DNA模板的残留(10)。为了减小此因素的影响，我们通过再次DNase处理使得RNA标准品中残留DNA浓度减低4个数量级。

在纯净培养基和水样接种相关实验中(Fig. 2和3), 目标DNA可被精确定量。采用培养基接种，单个细胞的16S rRNA和invA基因拷贝数均比预期值高4倍(Fig. 2B).这是由于在对数增长期染色体会出现加倍的情况。在此快速扩增期之后，一拷贝的invA约对应8拷贝的16S rRNA基因。这和预期值是相符的，表明invA是单拷贝基因并在沙门氏菌有7个rrn操纵子(11)。因此，沙门氏菌的DNA的回收率约为100%(如样品离心，细胞裂解，DNA提取和纯化)。对于接种样品，回收率约为70%(如0.7拷贝的invA 和2.9—5.8拷贝的16S rRNA基因)。但现今研究中，从相同水样中提取革兰氏阴性菌的效率从未超过52%。核糖体16S rRNA的拷贝数在对数早期增加很快(18), 而实验的后期却出现了下降。每CFU的16S rRNA拷贝数界于20,000到500,000。核糖体数目和细菌的生长生理状况息息相关，单个细菌细胞的核糖体数目为6,700到71,000(2, 5, 8)，和上述结果相符。既然纯化的小RNA被作为外参，那么16S rRNA的拷贝数就不会被过高评价。实际上，参照比样品的反转录效率以及后续的Q-PCR效率都要高(低估的可能性比高估的可能性要大)。因而，在复合培养基(如, BHI)中生长极快，得出的拷贝数稍高于实际值。采用基因组DNA做参照对葡萄球菌16S rRNA的研究表明，每拷贝16S rRNA基因对应35个16S rRNA的拷贝(23)。但是，Q-RT-PCR中一般不采用DNA作为参照，因为反转录的效率会在90%－1.4(4, 15)。这会造成目标RNA的过低估计。接种水样中的16S rRNA表达率和培养于纯净培养基静止期表现相同(Fig. 3C)。但接种少量菌体的饮用水样的对应值比较低。原因是菌体在饮用水培养条件下无法达到适宜的生长状态。另一方面，核酸的提取和纯化也是一个限制因素。

本文以Q-PCR为基础，建立了一种不仅可以对DNA，还可以对细菌RNA进行精确定量的实验方法。细菌的生理生化状态是和每个细胞16S rRNA的数目息息相关的。这种新的方法被应用到环境样品的定量，样品活性监测，以及采用合适的靶序列，检测细菌的生理状态及潜在致病性。