实验材料和方法

菌株和生长条件 
沙门氏菌ATCC14028置于心脑浸出液培养基中在37℃摇瓶培养（100rpm）。通过测量600nm的光密度值对菌体的生长情况进行监测。为了统计活细菌数目，样品经BHI梯度稀释后取50ul涂于BHI琼脂板上生长。37℃孵育24h后，统计每毫升的CFU值，仅选取克隆数为20－300所对应的稀释度进行计数。
核酸提取
按照厂商提供的方法(QIAGEN, Hilden,Germany)，采用DNeasy和Rneasy试剂盒分别对DNA和RNA进行提取。对于RNA提取，需加入100ul的溶菌酶(500 ug/ ml－1)室温消化5min。在室温下用DNA酶处理(QIAGEN) 30min。
Q－PCR的引物设计及标准品设计
所有的引物均购买于MWG Biotech (Ebersberg, Germany). Q－PCR和Q－RT－PCR的目标序列为编码伤寒沙门氏菌invA和16S rRNA的基因以及对应的RNA。为了给目标序列精确定量，我们设计了DNA和RNA标准品。对下面两种情况我们设计了另一套引物：(i1) 引物分别位于第一套引物扩增序列的上游和下游（如长扩增片断）；(ii) 上游引物包含T7启动子序列（表1）。这些引物用于扩增S. enterica的基因组DNA，方法如下：初始变性94℃4 min；94℃1min，58℃(invA)/60℃(16S rRNA), 72℃1min,30个循环；最后一步延伸72℃6min。PCR混和液(每个样品50ul体系)包含：5ul 10×PCR缓冲液(QIAGEN)，3 mM MgCl₂, 200uM dNTP (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 400 nM (每份) 引物, 0.2ul Taq 聚合酶(QIAGEN), 1ng基因组DNA。PCR产物采用PCR 纯化试剂盒提取(QIAGEN) 并作为Q-PCR的DNA标准品。为了得到RNA标准品, 我们用Riboprobe System-T7 (Promega)试剂盒来对纯化PCR产物进行体外转录。随后用DNase I (15 min, 37°C)进行消化，并用RNeasy minikit (QIAGEN)提取所得的RNA，提取中还在柱上经历了一次DNaseI消化（室温15 min）。转录产物用1%的甲醛电泳分析。DNA和RNA标准品分别用PicoGreen (双链DNA定量试剂盒) 和RiboGreen (RNA定量试剂盒)获得（27）。标准品用无核酸酶的水稀释后置于－20 (DNA)或－70°C (RNA)保存。
拷贝数的计算
Q-PCR标准品拷贝数计算如下：平均来说，1bp的双链DNA分子量约为660Da，而一个单链的RNA核苷约为340Da(PCR applications manual, 2nd ed., Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany, 1999)。计算方程式如下：拷贝数/纳克＝(n×mw)/(NL×10^－9)，其中n是标准品碱基对或核苷长度，mw是指每个碱基对或核苷的分子量，NL则为阿伏加德罗常数(6.02×10²³分子数/摩)。
Q-PCR和Q-RT-PCR
Q-PCR过程中，把5ul的稀释样品加到20ulPCR混和液里，PCR混和液由2×SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)制备而来，并添加引物至终浓度400 nM。循环反应参数如下：95°C 10 min；95°C 20 s，60 (invA)或65°C (16S rRNA gene) 1 min，50个循环；接下来再进行95°C 20 s，60 (invA)或65°C (16S rRNA gene) 1 min。确定熔解曲线时，65°C到94°C每20 s上升1°C。对于Q-RT-PCR，在Q-PCR之前则采用SYBR Green RT-PCR试剂(Applied Biosystems)以及随机引物按试剂盒说明合成cDNA。RNA标准品也按照相似的方法合成。反转录过程中，一些RNA样本没有充足的反转录酶以消除DNA污染。相对两步法来说，一步Q-RT-PCR扩增法采用了SYBR Green RT-PCR试剂和序列特异性引物。虽然两者在扩增效率上没有差别，但两步法Q-RT-PCR常用于需进一步研究的实验中（如cDNA的长期保存，用同样的cDNA模板对不同靶基因进行定量）。上述Q-PCR和Q-RT-PCR都是在RotorGene 2000 (Corbett)上完成的。
数据分析
为产生标准曲线，系列稀释的DNA或RNA标准品(1,000 pg to 0.001 fg)在每轮Q-PCR反应中得到量化，并通过RotorGene software, version 4.6绘出标准曲线。对于每一个标准品，其浓度和荧光信号增长高于背景或达到域值时对应的循环数(Ct值)一一对应。标准曲线的斜率通过下列公式确定反应的效率：efficiency = 10-1/slope-1。由此可见，扩增效率等于1表明每一次循环中产物得到成倍扩增。通过标准曲线，RotorGene的配套软件可计算出待测样品的初始模板量。通过这些数值，我们便可以算出每毫升培养基或接种水样中模板拷贝数。