实时定量PCR技术原理

提要

􀂙基本概念
􀂙定量PCR的数学原理
􀂙定量PCR的化学原理
􀂙等位基因鉴定原理
􀂙定量PCR仪光学原理

基本概念

什么是PCR？

•PCR能否只用一条引物？三条引物？
•PCR能否使用ddNTP？

典型的PCR四阶段

PCR理论方程

N = N₀×(1 e)ⁿ

N:产物分子数

N₀:起始分子数

e：扩增效率

n:循环次数

循环次数

起点定量与终点定量
起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；
终点量经过PCR 放大，并非研究所期望的数据􀁺
起点定量误差小，终点定量误差大


标准曲线方法

通过CT值测定起始DNA量

定量PCR的数学原理

什么是C_T值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数

从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数

线性图谱

C_T值

半对数图谱

C_T值

•浓度增加1倍，CT值减小1个单位
•浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
为什么C_T ∝起始DNA浓度?

C_T值与起始DNA浓度的关系

•单拷贝检测在理论和实验上能做到吗？
•最理想的标准曲线斜率是多少？

什么是阈值
基线信号的标准偏差×10

基线→阈值→C_T值

基线调整规则

如果C_T值>18，不需调整，使用自动分析结果

如果C_T值<18，修改终点，再分析一次

起点：进口试剂取3，国产试剂取6

终点：最小的CT值–4，通常为15

长度：大于或等于6个循环

PCR方程只在指数期成立
CT值和阈值必须位于指数增长阶段内


手工数据分析方法

1.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱
2.如果C_T值> 18，使用自动分析结果，出报告
3.如果有C_T值<18，根据[最小的C_T值-4]
修改基线终点，重新分析数据

软件自动的数据分析方法

软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度

•能否用鼠标拖阈值线以正确区分阴性与阳性？
•阈值与DNA浓度成反比，对吗？