反转录差异显示技术(DDRT-PCR)及其方法的改进

朱　靖1，杜立新2?

（1.山东农业大学动物科技学院生物工程实验室，山东泰安 271018; 2.中国农业科学院畜牧研究所，北京 100094）?

Methods and Improvements of mRMA DDRT?

ZHU Jing1, DU Li－xin2?

(1.Biology Engineering Laboratory,College of Animal Science and Technology，Shandong Agriculture Univercity，Taian，Shandong，?271018，China;2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing，100094，China)?

Abstract: DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR technique is the available method very frequently to search and clone new genes.By using this technique it can comprehend the genic expression of different cells or the same cells in different periods.This technique provide important information for the investigation of all kinds of life activties. First this paper summarized the principled merits and shortage of DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR.Secondly,it emphasized the improved techniques, which include the purification of mRMA, RT,the design of primer, parameters of PCR, electrophoresis, the marker of isotope, silver staining and the mode of hybridization and so on.Last,it introduced the development status of DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR and analyzed the application of foreground.?

Key words：DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR;reverse northern blot;silver stainning

摘　要:　运用mRMA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况，为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理,优点与缺点,以及近年来对该技术涉及的PCR/RTPCR/index.html">RT-PCR方法、引物设计、PCR反应参数、电泳及差异条带的显示方法以及杂交方式进行了论述和评价，并对其应用前景进行了简单分析。?

关键词：反转录差异显示PCR;反向northern印迹;银染 ?

基因的差异性表达不仅是细胞形态和功能多样性的根本原因，而且也是各种生理及病变过程的物质基础，因此，分离、鉴定差异表达的基因具有重要的意义。真核生物基因组中，仅约10％～15％的基因在细胞中表达，而且不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中表达的基因也不尽相同。1992年美国哈佛医学院的两名科学家Liang P和Pardee A D 根据高等生物成熟的mRMA都带有poly(A)的特性，用特定的锚定引物反转录后，进行PCR扩增，率先建立了mRMA差异显示技术^[1]。1994年Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应（DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR）。与研究RMA差异相比，研究mRMA的差异排除了非编码区的影响，使研究范围缩小到表达基因水平上，为人类进一步了解生命过程打开了大门。?

1 DDPCR/RT-PCR技术的基本原理?

真核生物基因的mRMA 3′端多数都带有一段多聚腺苷酸结构，有12种组合：5′-NMAAA…AA-3′其中N代表A、G、C、T任意一种碱基，M代表G、C、T任意一种碱基。根据此种序列特征，按碱基配对的原则，人工合成Poly(dT)引物时在其3′末端加上两个锚定碱基引物：5′-TTT…TTTMN-3′（M，N同上）。此引物可将mRMA反转录成cRMA（又称为第1链），用此引物锚定cRMA第2条链3′端，用5′端随机引物与cRMA第1条链互补进行PCR，随机扩增cRMA片段。将PCR产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，即可显示不同的条带位置，比较不同组间的显示结果，挑选差异条带，经回收再扩增，通过杂交验证、克隆">克隆测序等，进一步分析其结构与功能。杨谊等认为DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR技术可用于多种研究目的，如鉴别和观察基因表达的改变，差异表达基因的迅速测序并与基因库比较，单个的差异表达基因片段能迅速克隆">克隆并制成探针从cRMA文库或基因组文库中分离基因。?

2 DDPCR/RT-PCR技术的优点?

当前,寻找差异表达基因的方法除了DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR之外，还有减杂交（subhybridization,SH）、抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridiza-tion, SSH）、RMA随机引物PCR（RMA-arbitrarily primed PCR, RAP-PCR）、代表性差异分析（representational difference analysis, RDA）、RMA微阵列（RMA Microarray，或RMA芯片）和基因表达系列分析（serial analysis of gene expression, SAGE）等。据美国Medline 1999年12月的调查，用以上方法来克隆">克隆差异表达基因的文章共计1 810篇，其中有67％是采用DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR技术^[2]，由此可见其实用性和广泛性。DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR的优点可概括为3SRV(simplicity,sensitivity,speed,reproducibility,versatility)^[3]：①简单，技术上仅仅依靠PCR和RMA测序胶电泳；②可以同时分析多组样品；③灵敏性高，仅需0.2 μg总RMA作为起始材料，可检出低丰度mRMA；④实验周期短，约8 d即可完成，便于重复；⑤最突出的优点是实验过程中可步步验证比较；⑥可进行多基因家族的表达分析。?

3 DDPCR/RT-PCR技术的不足?

（1）假阳性率高，假阳性的比例有时高达50％～75％。（2）由于某些序列的特异性，一些差异表达的转录不能得到分离^[4]，所以凝胶中的单条带可能由1种以上cRMA片段所构成。（3）差异显示所得的cRMA片段较短，长度多在100 bp～400 bp之间，且大多位于mRMA 3′端约300 bp的非翻译区（untranslated regions,3′UTR），很少能扩增到ORF（open-reading frame）范围内。（4）研究表明，差显技术对高丰度mRMA具有明显的倾向性，不管用多少个10 mer引物，标准的差显技术并不能有效显示细胞中的大量mRMA^[5]。?

4 DDPCR/RT-PCR技术的改进?

4.1 PCR/RTPCR/index.html">RT-PCR改进?

RMA的纯度是PCR/RTPCR/index.html">RT-PCR实验成功与否的关键之一。通常采用TRIzol试剂盒提取RMA，但此法很难完全去除基因组RMA，需要用DNase处理。更简便的方法是使用mRMA选择性PCR反应试剂盒（例如大连宝生物工程有限公司生产的试剂盒），其原理是在 PCR/RTPCR/index.html">RT-PCR中由于使用了dNTP analog，降低了合成的cRMA的Tm值，在PCR反应时，cRMA可在较低温度（85 ℃）下变性，故只有Tm值较低的cRMA可以被扩增，而基因组 RMA由于低温下不能变性，故不能作为反应的模板被扩增。?

4.2引物设计的改进?

设计引物首先必须遵循以下原则^[6]：①在任何方向的阅读框中均无终止密码子；②无形成发夹结构的倾向；③序列中应包括哺乳动物最常见的密码子；④GC含量在60％～70％之间；⑤尽量少用甘氨酸密码子；⑥引物之间应无交联倾向；⑦引物中不应出现连续两个以上的碱基可折转配对互补。Liang等(1992)设计的第1代引物：3′端引物为5′T₁₂MN，理论上3′引物可覆盖mRMA总类的1/12,5′端引物为?20种10 mer引物，同3′端引物共有240种组合。Liang等(1994)所设计的第2代引物改两个碱基固定的Oligo（dT）引物为一个碱基固定的引物，即T₁₂A，T₁₂G和T₁₂C，且在引物的5′端各引入了一个HindⅢ酶切位点，5′端和3′端引物共有60种组合。第3代引物于1996年设计，GenHunter公司3′端poly(dT)锚定引物和5′端随机引物都带上HindⅢ酶切位点，引物条数分别减为3条和8条，而碱基数分别增加至18个和13个，这样经计算机同源性分析表明所得到的24个组合同样能覆盖所有mRMA，使操作和后续处理更简便、快捷。MouL等(1994)在引物设计上发现，引物中含至少一个G比含一个C要好，以A或T为末端者效率很低，5′端GC组合比3′端GC组合效率要高。?

4.3 PCR反应参数?

据近期技术报道，13 mer随机引物的最佳退火温度范围是40 ℃～50 ℃；延长时间为30 s～120 s效果最佳；dNTP的浓度范围为2 μmol/L～50 μmol/L；随机引物的浓度为0.1 μmol/L～2.0 μmol/L之间，根据所取样品灵活掌握。也有探讨快速DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR方法^[7]，其前提条件是必须提高dNTP的浓度（从2.5 μmol/L提高至25 μmol/L或250μmol/L），依据是在68 ℃～80 ℃范围内，Taq- RMA聚合酶的延伸速率为100 nt/s，按温度改变率1 ℃/s计算，从68 ℃向80 ℃升温的过程中可扩增1.2 kb的RMA。?

4.4电泳与差异条带的显示?

只有长度为100～500个碱基的扩增条带才适合于测序胶上显示^[1]。电泳时常发现多数带成簇出现，其原因可能是同一cRMA片段的互补带或3′末端A造成的泳动速度差异引起的。Bauer等（1993）初次将非变性凝胶电泳用在差显技术上，依据是大多数双链RMA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率大略与其大小的log对数值成反比，但迁移率也受其碱基组成和序列的影响，以致大小完全相同的RMA其迁移率可相差达10％，此方法降低了显示谱带的复杂性，同时简化了后期进行克隆">克隆筛选的工作。电泳结束后，进行放射自显影。有用³²P或 ³³P代替原方法中的³²S，由于³²P或³³P的能量高且稳定，可提高电泳条带放射自显影的分辨力，缩短曝光时间，同时，将同位素标记反应底物dNTP改为末端标记锚定Oligo(dT)引物，使只有5′端和3′端引物之间的扩增产物才能被显示，而两个5′端引物之间的扩增产物则不被显示，这样就减少了“人工条带”造成的假阳性，提高了灵敏度和特异性。

Lohman等（1995）建立了银染差异显示方法，核酸银染方法是一种高灵敏度检测核酸变化的方法，其灵敏度可以检测pg水平核酸的变化，与同位素放射自显影方法具有相似的灵敏性。采用银染显示法不仅快速简便（从RMA提取到差异条带回收仅需2 d～3 d），而且假阳性率很低。梁德勇等（1999）优化了快速简便的银染mRMA差异显示方法，其结果是,RMA加入量为1 μg～3 μg，PCR/RTPCR/index.html">RT-PCR反应能扩增出较多的cRMA条带，而低于0.5 μg时扩增条带数目较少；在36 ℃～42 ℃的范围内，随温度的增加扩增的条带减少，而42 ℃时扩增的条带数目锐减，特别是当RMA加入量小于1 μg时几乎无条带显示， 36 ℃?扩增的条带过多而趋于smear；优化了银染液程序，染色液和显色液中370 mL/L甲醛的量分别为0.03％～0.05％和0.075％～0.1％，显色温度4 ℃～12 ℃时，显示出清晰条带。为减少放射性污染，Chen等(1996)报道以地高辛（digoxige-nin, DIG）标记poly-T引物，进行PCR扩增，扩增产物于60 g/L聚丙烯酰胺凝胶上变性电泳，凝胶浸泡于含抗DIG-碱性磷酸酶抗体的溶液中使电泳条带显现，可直接从凝胶上回收差异信号。此外还有荧光标记^[8]，EB染色? ^[9] 等的非同位素标记的方法报道。?

4.5杂交方式的改进?

为了排除假阳性的干扰，采用反向RMA斑点杂交及半定量PCR/RTPCR/index.html">RT-PCR两种方法来双重验证。反向Northern是Zhang H等^[10] 在1996年首次提出的，该方法是将获得的差异片段结合到尼龙膜上，分别用对照和处理材料的RMA进行反转录标记，制备成探针。反向Northern印迹杂交可以在一次试验中将全部待测的片段进行检测，而Northern印迹杂交很困难；对于那些短的或无意义的片段反向Northern印迹杂交可以一次去除，而用Northern印迹杂交方法一次试验很难区分，须经几次重复试验才能判断；此外，反向Northern印迹杂交是一种比较节省、快速的方法^[11]。但是试验中还需注意：挑选差异片段时，应尽量避免那些较短的片段，同时必须保证反转录酶有足够的活力，必要时进行重复试验验证。?

5 展望?

DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR从基因的转录水平着手研究基因的表达，并已得到了令人欣慰的成果，这些成果又促进了该技术的发展，有关的专著及试剂盒亦已相继问世，差异显示技术的发明者Peng Liang博士从1997年开始，每年举办一期培训班。所有这些都有利于DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR方法的推广与应用。在DDPCR/RTPCR/index.html">RT-PCR的基础上，又产生了一系列的衍生技术，如EDD(enhanced DD)、 ODD (ordered DD)、GDD(genomic DD)、LDD(long-distance DD)等，这些方法是一些极有效的研究基因表达差异的方法。将来通过利用传统方法和现代方法的结合是比较基因表达差异的强有力工具，基因表达差异的比较分析将有助于人类在基因水平上理解发育分化、生殖和疾病发生机理等基本的生物学问题。?