一．实验原理

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）简称PCR，它是一种DNA体外扩增技术。1985年美国的Mullis等人发明了PCR技术，在体外利用模板DNA 、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶，通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程，模板DNA就可得到大量扩增。在PCR过程中，DNA的延伸起初是用大肠杆菌的DNA聚合酶I（Klenow片段）来完成的。由于大肠杆菌的聚合酶不耐热，每次加热变性DNA后都要补加新的聚合酶。这不仅增加了实验成本，而且当同时扩增多个样品时极易出错。在耐热DNA聚合酶（Taq酶）发现后，才使PCR技术的广泛应用成为可能。特别是自动热循环仪（又叫DNA扩增仪）的发明，使PCR反应过程可以电脑控制，实现了自动化。PCR技术的发明虽然只有10多年的时间，但目前这一技术及其衍生的其他实验技术在生物学的许多领域已得到了广泛的应用。

随机引物PCR（Arbitrary - primer PCR，缩写为AP-PCR）又称随机扩增多态性DNA（Random amplified polimophic DNA，缩写为RAPD），是Williams和Welsh等1990年在PCR的基础上发展起来的一种实验技术。在RAPD扩增中，仅用一个8-10碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机的。RAPD反应的条件与普通PCR基本相同。但由于引物较短，一般退火所需温度较低。RAPD与普通PCR的另一个明显的不同是前者不需知道模板DNA的序列，扩增出来的片段也是非特异性的；而后者则必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的引物。

RAPD技术一出现，便以它的简便、快捷和多态性捡出率高而引起科学工作者的极大兴趣。目前这一技术已被广泛用于遗传图谱构建、群体遗传结构分析、DNA指纹分析和基因定位等不同研究领域。

二．实验步骤

（1）在0.5ml无菌离心管中依次加入下列溶液（在超净台上操作），加入后轻轻混匀。

             无菌水                                  13μl

             10×扩增缓冲液                  2.5μl

             4dNTPs溶液                        1.5μl

             引物                                      2.5μl

             植物DNA（5ng/μl）        5μl

             Taq DNA聚合酶                  0.5μl

             总体积                                 25μl

（2）加入100μl矿物油，遮盖反应混合液的表面。

（3）将试管转入DNA扩增仪，按下列条件进行扩增循环（需预先调节），共进行45个循环：

              变性                         复性                        聚合反应

     94°C ，1分            35°C，1分                72°C，2分

（4）循环完成后，在72°C再延伸6分钟。

（5）将反应产物在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察扩增的DNA条带。

 三．实验材料

1．实验样品

玉米或小麦核 DNA（用CTAB法提取）

2．化学试剂和溶液

（1）       4种dNTP混合溶液，浓度各为2 mmol/L

（2）       Tag DNA 聚合酶（2units/μl ）

（3）       10ⅹ扩增缓冲液

500mmol/L           KCl

100mmol/L           Tris.HCl(pH8.3)

15mmol/L            MgCl₂

(4)             矿物油

(5)             1.4%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭0.5μg/μl）

(6)             5ⅹTBE 缓冲液

(7)             扩增引物（10个碱基的寡核苷酸片段），浓度为4μmol/L

(8)             DNA分子量标记：λDNA(EcoRI/HindⅢ双酶切)

3．仪器设备和消耗品

DNA扩增仪，电泳仪，电泳槽，移液器，离心管和移液器吸头等。

四．注意事项

（1）溴化乙锭有致癌作用，操作时一定要戴手套。

（2）同一DNA样品可用不同的随机引物进行扩增。

（3）DNA摸板和镁离子的浓度可进行调整，以得到稳定的扩增效果。

（4）所用离心管、吸头和溶液等都要严格灭菌，在超净台上操作，以防反应体系被外源DNA污染。

五．思考题

１．  Taq DNA聚合酶有何特性使之可以用于聚合酶链式反应？

２．  根据自己的实验观察，你认为哪些事项是PCR操作成功的关键所在？