原理

?所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。?

免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。

操作程序

(1) 随机引物标记操作程序如下：?

①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。?

②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。?

③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。?

④置37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。?

⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。?

??可根据下表估计标记产量：

(2)核酸探针膜上杂交原理和操作?

（一）杂交总原则?

脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。某些条件(如酸碱、有机溶剂、加热)可使氢键断裂，DNA双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链，DNA单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。?

 

（二）杂交膜的选择?

杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液(0.1×SSC，0.1%SDS)煮沸5-10分钟后去除探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。?

 

（三）探针浓度?

探针浓度是获得理想杂交检测的关键因素，浓度太高则会导致本底太深；若浓度太低又会导致信号减弱。为了解决过高探针浓度所引起的高背景，必须进行模拟杂交实验。?

所谓模拟杂交实验，即选择几小片杂交膜，在未转移DNA的情况下，进行封闭、不同浓度的探针孵育及随后的免疫检测。以背景能被接受的最高探针浓度为正式杂交实验的浓度。模拟杂交实验不 同浓度的探针可以参考下述方法配制：取5μl标记反应液加1ml探针稀释液，混匀。取0.5ml等倍释后，再取0.5ml继续等倍稀释。假设20μl标记反应液中含1μg标记的探针，则系列稀释探针的浓度分别是：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml。?

（四）预杂交和杂交液?

预杂交和杂交都使用相同缓冲液，不同的仅仅是预杂交液中不含有探针。下面是几种基本杂交液配方：?

①Standard buffer: 5×SSC,0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine,0.02%(w/v)SDS,1% Blocking Reagent。?

②Standard buffer+50% formamide∶50% formamide(deionized),5×SSC,0.1%(W/V)N-Lauroy lsarcosine,0.02%?(w/v)SDS,2% Blocking Reagent。?

③High SDS buffer(Church buffer):7%SDS,50% formamide(deionized),5×SSC,2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,0.1% N-Lauroylsarcosine?

 

DNA片段经电泳分离后按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。1975年Southern发明了利用浓盐溶液的推动作用将变性的单链DNA转移到硝酸纤维素膜上的方法，解决了原位转移的问题。虽然其原理和操作均很简单，却是基因分析中必不可少的手段，已经得到了广泛的应用。?Southern印迹杂交包括两个主要步骤①把电泳分级的DNA转移到固相支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。?

首先将DNA用限制性内切酶消化。准备一定浓度的琼脂凝胶。琼脂凝胶必须是高纯度和核酸级的。电泳后经溴化乙锭染色并在紫外灯下照相后，将需要转移的琼脂糖凝胶切下，放入搪瓷盘中，然后进行下面的步骤。?

试剂?

a.0.25M HC1?

b.变性液：0.5N NaoH,1.5M Nac1?

c.中和度：0.5M Tris-HC1,pH7.4,3M Nac1?

d.20×SSC：0.3M柠檬酸钠,3M Nac1?

e.2×SSC：0.03M柠檬酸钠,0.3M Nac1?

程序：

（1）将胶浸入0.25M HC1中10分钟。HC1处理的作用主要是通过去嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。?

（2）进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。?

（3）把胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。?

（4）蒸馏水漂洗凝胶2次。?

（5）把胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。?

（6）在处理凝胶的同时，切一张与胶同样大小的尼龙膜或硝酸纤维膜。硝酸纤维膜用2×SSC浸泡。

剪两张Whatman3#滤纸和一叠吸水用的粗滤纸注意不能用手指直接触及膜面。?

（7）准备转移用平器和支架，平器中放20×SSC。架子上搭滤纸桥使溶液能够虹吸上来。?

（8）依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水滤纸，玻璃板，适量重物(500-1000g)?

注意：要检查PH值，用硝纤膜时PH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部“绝缘”，气泡处的DNA难以被吸到硝酸纤维膜上。?

（9）于室温转移12-20小时。?

（10）取出转移膜，用2×SSC漂洗数次，以去掉可能粘附于膜上的凝胶。?

（11）固定：可选择下述方法之一进行DNA固定?

·紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20分钟，简单漂洗后干燥备用。?

·尼龙膜置+120℃烘烤30分钟。?

·硝纤膜置真空烤箱中，80℃减压烘烤2-2.5小时，以避免硝纤膜自熔。若无真空烤箱，

亦可在普通烤箱中65-70℃烘烤3-4小时，也能达到固定目的。?固定后，将膜封于塑料袋中，保存于干燥处待杂交。?

注意事项?①转移液的盐浓度对转移具有一定影响。应选择20×SSC快。10×SSC转移速度较快，对于高分子量DNA(〉10Kb)效果比较理想。因此要根据不同目的选择适当的转移液。?

②转移时不能移动上边重物，防止出现“重影”现象。?

③硝酸纤维膜对于0.5kb以下的小分子DNA结合不牢，转移时容易丢掉。要探测小片时最好用尼龙膜。?

2 .  Southern印迹杂交杂交成功的关键因素之一在于选择杂交液。应通过预实验来选择合适的杂交液。另一个比较重要的因素是标记探针的浓度，一般选择5-25ng/ml?，应通过模拟杂交实验来选择合适的探针浓度。?

试剂?

a.Standard buffer?

b.Standard buffer+50% formamide?

c.High SDS buffer?

d.Wash Solution I:2XSSC,0.1%SDS?

e.Wash Solution Ⅱ:0.5XSSC,0.1%SDS?

程序?

①将转移好的尼龙膜或硝纤膜装入塑料袋中，每边各留2-4mm空隙。灌注杂交液的一边留1cm空隙。在角上剪开一个小口，灌注预杂交液，从切口处赶走气泡，用封膜机封口，浸入水浴中。?

②根据所选择的不同预杂交液，采用不同的温度预杂交4-20小时：Standard buffer:预杂交温度65-68℃，Standard buffer+50% formamide:37-42℃，High SDS buffer:37-42℃。

③使用双链DNA探针时，沸水浴10分钟以变性探针。然后迅速插入冰中。?

按模拟杂交实验所确定的探针浓度将适量探针加入到预杂交液中，配成杂交液，一般浓度5-25ng/ml?。按每100cm2膜加入至少3.5ml配制杂交液。?

④使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。?

⑤杂交结束后，取出杂交袋，剪开一个小口，将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20℃以备下次使用。这样至少可保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃10分钟以变性探针。杂交液如含有50%甲酰胺，则在68℃变性10分钟即可。?

⑥取出杂交膜，用Wash Solution I洗5分钟×3次。?

⑦保温冲洗：用Wash SolutionⅡ于68℃冲洗15分钟×2次。?

 

此检测方法用于快速定性筛选DNA。样品可以是纯化DNA，也可以是细胞碎片PCR扩

的DNA。预杂交和杂交方法与Southern基本一致，不同的仅是样品的处理不同。?

试剂：DNA dilution buffer∶10mM Tris-HC1；1mM EDTA,PH8.0；50μg/ml herring  Sperm DNA?

程序?

①将样本DNA稀释成不同浓度。?

②将样本DNA于+95℃水浴10分钟，迅速插入冰中。?

③取1μl点样至尼龙膜或硝纤膜上。点样前先画上圆卷做记号。?

④用紫外线照射固定或+120℃烘烤30分钟固定。?

其后杂交步骤Southern相同?

（七）DAB显色检测法?

试剂：

a. .Biotin—Mouse  Anti—Digoxin                200μl

b. SABC—POD                                200μl

c. DAB Stock Solution                           5ml

d.冲洗液：0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1, PH7.4。?

e.封闭液：1% Blocking Reagent/0.1M Tris-HC1,0.15M Nac1。?

f.显色缓冲液：0.1M PBS,150mM Nacl,PH7.4。?

g.TE缓冲液：10mM Tris,1mM EDTA,PH8.0?

?

程序：

1.         经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。?

2.         用干净的杂交袋或平皿，封闭液室温封闭60分钟。?

3.         用冲洗液冲洗5分钟×3次，每次100ml?。

4.         用封闭液(e)1：1000-2000稀释Biotin—Mouse  Anti—Digoxin，例如10μl Biotin—Mouse  Anti—Digoxin加至10-20ml封闭液中(稀释液+4℃可稳定24小时左右)。将适量稀释抗体加入杂交袋中37℃反应1-2小时。?

5.         用冲洗液冲洗5分钟×3次，每次100ml?。

6.         用封闭液(e)1：1000-2000稀释SABC，例如10μl SABC加至10-20ml封闭液中(稀释液+4℃可稳定24小时左右)。将适量稀释SABC加入杂交袋中37℃反应1-2小时。?

7.         用冲洗液冲洗15分钟×3次，每次100ml。

8.         按1：40配制底物显色液：250μl储备液加至10ml显色缓冲液中，用前加最终浓度为0.03

    %的H2O2，室温显色5—30分钟左右。?当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录。还有一种选择是让膜干燥保存。?

所谓原位杂交是指在保存染色体、细胞或组织结构的前提下，用探针定位检查出相关基因序列。结合免疫细胞化学，原位杂交可以揭示出基因在DNA、mRNA水平的表达。?

原位杂交技术最早Pardue and Gall和John etal。分别在1969年发现。最初，放射性标记技术是唯一的方法，其使用受到明显限制。由于非放射性标记技术的简单、高敏感性，为原位杂交技术广泛应用开避了道路。

为了展开染色体，酒精清洁玻片即可。但为了防止细胞和组织的脱落，必须用多聚赖氨酸或APES处理玻片。?

为了保存形态结构，生物材料都必须予以固定。染色体的固定比较简单，甲醇/乙酸固定即已足够。如果是石蜡包埋组织，采用福尔马林固定。冰冻切片采用4%甲醛或Bouin's固定液固定30分钟。应予注意的是，DNA和RNA虽然不和各种交联剂反应。但包围DNA.RNA的各种蛋白质和交联剂反应后，就会遮盖住靶核苷酸。因此，必须采取各种增加通透性的程序。?

a. 内源性酶的灭活?

如果用酶作为标记物，内源性酶必须预先予灭活。如过氧化物酶，可用1%H2O2/甲醇30分钟处理。至于碱性磷酸酶，由于杂交过程的破坏，残余碱性磷酸酶的活力会完全消失。?

b.RNA酶的处理—DNA-DNA杂交时需要处理内源性RNA。

内源性RNA的存在，会由于DNA-RNA的杂交而增加背景。处理方法：DNase-free RAase(100μg/ml)/2×SSC,37℃孵育60分钟。(SSC=150mM Nac1,15mM Sodium Citrate,PH7.4)?

c.HC1处理?用200mM HC1处理20-30分钟可以增加信/噪比值，其机理尚不清楚。可能与蛋白的

抽提和部分功能核苷酸片断的溶解有关。?

d.去垢剂处理?

在脂膜成分未被固定，脱水、包埋等程序抽提时，可以进一步使用去垢剂处理，如Triton X-100,

Sodium dodecyl Sulfate等，同样有助于原位杂交技术。?

e.蛋白酶消化?

蛋白酶消化有助于增进探针和核苷酸之间的接触性。消化通常用蛋白酶K，溶于20mM Tris-HC1,2mM Cac12，PH7.4 ,37℃ 15-30分钟。蛋白酶K浓度依不同对象来确定。?

例如对染色体和核的分离部分，可以用1μg/ml蛋白酶K。

对染色体DNA的原位杂交，必需进行变性处理。热变性越来越常用，它不仅简单，而且效果很好。对不同的杂交，应试验不同的时间和温度，以找到最佳的变性条件。?

热变性时，探针和靶基因可以同时变性。将探针加到玻片上，盖上盖玻片。玻片放到80℃，2分钟后取出冷却至37℃。如果是组织切片，变性时间应达到80℃10分钟。组织和细胞mRNA的杂交则不需变性处理。

标记探针能够和其序列具有部分同源性的基因非特异性的杂交。这类杂交分子的稳定性总是不及完全同源的杂交分子。分别用不同强度冲洗液可以有效地洗掉非特异杂交的/探针，而保留特异杂交的探针。冲洗液的强度可通过改变甲酰胺浓度、盐浓度和温度来控制。通常用2×SSC＋50%甲酰胺来冲洗。有时可用更高强度的冲洗液。总的来说，杂交时用高强度缓冲液，冲洗时用低强度的冲洗液(盐浓度越低，甲酰胺浓度越高和温度越高，则冲洗强度越大)?。

免疫细胞化学和常规方法一样，必须先进行非特异性的封闭处理。如探针为地高辛标记时，Tris-HC1缓冲液含“Blocking Reagent”。此外0.4M NaCl的加入也有助于降低背景。 免疫细胞化学中最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶。前者用DAB作显色剂。后者用BCIP/NBT作显色剂，方法同膜上杂交。显色强度由显微镜下控制。?

a.探针长度：原位杂交和其它杂交方法不同，它要求较短的探针。因为探针越短，渗透性越强，可以渗透至细胞内部和染色体。不同的杂交所允许的最小核苷酸如下述公式所计算：?

b.探针浓度：浓度越高，则杂交速度越快。但过高的浓度也会使背景增加，因此，宜选择可接受背景的最高探针浓度。?

c.硫酸萄聚糖：在水溶液中，硫酸萄聚糖是高度水化物质，因此使得大分子(如探针)难以接触到其结合水，相对浓度大大增加，杂交速度明显加快。?

d.碱基错配：碱基错配会引起杂交速度及二倍体的稳定性下降。因此在严格的杂交条件下，可以阻止探针与靶基因的非特异结合。?

e.冲洗条件?

适于DNA探针〉100bp?

⊙50%去离子甲酰胺?

⊙2×SSC?

⊙50mM NaH2PO4/Na2HPO4,  PH7.0?

⊙1mM EDTA?

⊙载体DNA?

任选组合：

1×Denhardt`s?

dextran sulfate,1-10%?

温度37-42℃?

杂交时间：5-16小时?

目前，原位杂交已成病理学的一个有力工具，原位杂交可以用于诸如病毒，癌基因，基因突变等领域的检查。尤其是非放射性标记探针技术，为更多的实验室广泛应用原位杂交创造了条件。对福尔马林固定、石蜡包埋切片的原位杂交，关键是以下三个步骤?：

①靶DNA的暴露。这要靠精心设计的消化步骤。?

②DNA的变性和杂交。?

③杂交的分子的冲洗和检测。?

①去污剂浸泡一晚，大量自来水冲洗，然后用蒸留水清洗。?

②干燥之后，浸入丙酮中3分钟。?

③玻片移入1：50丙酮稀释的APES溶液中，浸泡5分钟。?

④玻片用蒸馏水略加清洗。干燥备用。处理后的玻片置干燥无尘环境可保存半年。玻片也可用“多聚赖氨酸”处理。?

①组织用常规4%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋。?

②常规切片。切片捞于涂有粘片剂的玻片上。?

③切片处理：先置60℃烘片30分钟。?

二甲苯脱蜡，逐级酒精至水清洗。?

④临用前配制蛋白酶K溶液：?

储备液：Proteinase K,10mg/ml H2O，小量分袋-20℃保存。将储备液用TES稀释成100μg/ml。（TES=5mM Tris-HC1,10mM EDTA,10mM Nac1,PH7.4?）

⑤每张切片用Proteinase k  20-30μl 37℃消化5-15分钟。消化过程中加盖硅化盖玻片，并置湿盒中。注意消化对组织原位杂交是至关重要的。过度消化会导致切片消失殆尽，消化不足则敏感性不够，因此应针对不同组织尝试不同的消化条件。?

①蛋白K消化后，去除盖玻片。用4%甲醛4℃固定5分钟。?

②蒸馏水洗5分钟。?

③让切片上水分滴下去，并在室温干燥5分钟。注意只能让切片上水份减少，不能让切片完全干燥。④每张切片加5-10μl探针(大切片需相应增加)。?

⑤设立严格的对照组，每张切片加5-10μl不加探针的杂交液。?

⑥切片上加硅化盖玻片，将玻片置+95℃变性6分钟。?

⑦把玻片放到冰上1分钟。?

⑧切片置温盒，42℃杂交3小时以上。如果方便，应杂交过夜。?

去掉盖玻片，按下述程序冲洗?

2×SSC洗5分钟×2次(室温)?

0．1×SSC洗10分钟(42℃)?

①切片置于0．1M TBS缓冲液中，PH7．4?

②每张切片加20-40μl封闭液：1%Blocking Reagont/0.1M TBS。?室温反应15分钟。?

③用封闭液1：1000稀释Biotin—Mouse  Anti—Digoxin  , 每张切片加20-50μl稀释试剂，湿盒室温反应1-2小时。用0．1M TBS洗5分钟×3次。

④用封闭液1：1000稀释SABC，37℃反应60分钟。0．1M TBS洗10分钟×3次。

⑤配显色剂：将DAB储备液用0．1M PBS，PH7．5缓冲液1：20稀释。加最终为0.03%H2O2。每    

  张切片加50μl，一般显色5-30分钟。信号弱时显色延长。?

下面的程序是用标记DNA探针来检测培养细胞中的mRNA。其它类型的检测可以参照此程序进行。

注意：所有溶液都必须用RNase抑制剂处理。?

①玻片用多聚赖氨酸处理。直接用5% CO2在玻片上培养细胞。所用培养基为无酚红Dulbecco's基础培养基。?

②37℃PBS清洗细胞。然后用下述固定液室温固定30分钟：4%甲醛，5%乙酸和0．9%NaC1。③室温PBS清洗固定细胞，用70%乙醇储存于4℃?④杂交前用下述方法脱水：?

70%，90%和100%乙醇；10%二甲苯；然后再用100%，90%，70%乙醇，最后PBS洗二次。?

⑤用胃蛋白酶消化固定细胞：0.1%Pepsin/0.1N HC1,37℃5-10分钟。?

⑥PBS洗5分钟后，1%甲醛固定10分钟。PBS洗。

其余步骤参照组织切片程序实行。

1×SSC：150mM Nacl,  15mM  Sodium Citrate PH7.0?

20×SSC：3M Nac1,    300mM Sodium Citrate PH7.0?

10×SSC：1.5M Nac1 ,  150mM Sodium Citrate PH7.0?

Washing Solution 2×SSC：300mM Nac1,  30mM Sodium Citrate?

 Washing Solution 0.5×SSC：0.5×SSC+0.1%SDS?

Washing Solution 0.1×SSC:   0.1×SSC+0.1% SDS ?

N-Lauroylsarcosine:10%(w/v)in Sterile H20,filtered through a 0.2-0.45μm membrane ?

SDS 10%(w/v)in Sterile H2O:filtered through a 0.2-0.45μm  membrane ?

Denaturation Solution(for Southern transfer)：0.5N NaoH,1.5M Nac1?

Neutralization Solution(for Soutiern transfer)：0.5M Tris-HC1,3M Nac1,PH7.4?

Blocking Reagent ：

①加10g Blocking Reagent至100ml 0．1M TBS，PH7．4缓冲液中。搅拌以助溶解。 ②如果必要时，加0．1%DEPC(dimethylpyrocarbonate)?。?

Standard hybridization buffer:： 5×SSC,0.1 N-lauroylsarcosine 0.02% SDS 1% Blocking Reagent ?

Standard hybridization buffer+50% formamide：5×SSC， 50% deionized formamide,?

    0.1% N-Lauroylsarcosine,0.02% SDS?， 2% Blocking Reagent?

High SDS Concentration hybridization buffer： 7%SDS,50% deionizod formamide,5×SSC,?

 2% Blocking Reagent,50mM Sodium Phosphate,PH7.0， 0.1% N-Lauroylsarcosine?

 500ml High SDS hybridization buffer可按下述方法配制：?

100% deionized formamide250ml， 30×SSC83ml， 1M sodium Phosphate,PH7.0 25ml?，

10% blocking solution100ml，10% N-Lauroylsarcosine 5ml?

将上述混合液倒入有35g SDS的烧瓶中(通风橱)。搅伴促进溶解，最后加入灭菌水至500ml。储存于-20?

Detection Washing buffer：0.1M Tris-HC1,0.15M NaC1,PH7.4?

 Detection buffer： 0.1M PBS,150mM Nac1,PH7.4?

 TE buffer：10mM Tris-HC, 1mM EDTA,PH8.0 。?

玻璃和塑料器皿的硅化：先将待硅化器皿放入玻璃真空干燥器中；加1ml二氧二甲基硅烷于一小烧杯中，放入干燥器。将真空干燥器与真空泵相连。抽气至二氯二甲基硅烷沸腾。关闭真空泵，保持干燥器的真空。1-2小时后，慢慢往干燥器内通气，取出器皿180℃烘烤2小时，塑料器高压消毒，用前用水冲洗干净。

使用注意事项?

核酸探针的标记及杂交是一个很复杂的过程，步骤多耗时长，影响因素多。要想获得理想结果，每一步都应严格操作。下面几个问题尤其应予注意：?

无菌操作：标记和杂交的各种溶液应高压灭菌；含SDS，Tween20的溶液应在滤膜除菌后加入其它溶液；使用灭菌吸头。?

使用干净平皿：每次用前必须严格清洗?。

膜的操作：操作膜时戴无尘的手套；只用无齿镊操作膜的边缘。?

原位杂交：每步反应均应加盖硅化的盖玻片?

                     有关参考文献

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