(1)福尔马林浸泡标本的DNA提取

1.     福尔马林对DNA有一定的破坏作用，因此提取的工作很有难度。如果有条件最好使用试剂盒，另外组织尽量不要取边缘的，用PBS洗上几次，延长蛋白酶消化时间。提出的DNA先用分光光度计测一下含量，要是A260/280值小于1.8或大于2.2，就不要跑电泳了。若要跑电泳，最好在DNA提取后的48小时之内，否则会对条带有影响。

2.     福尔马林固定组织可以获得高质量DNA,但是由于固定后DNA发生断裂，所以与新鲜组织相比较，DNA片段要短一些。这种DNA用于短距离PCR是没有问题的，如果是长距离PCR可能会影响效果。

(2)从小鼠胸腺细胞中提取基因组DNA做PCR:

1.       由培养的细胞提基因组DNA做PCR，每次取1毫升左右的培养液，提取后即可做PCR了.

2.       一般来讲取少量细胞直接加入PCR反应体系中也是可以的。如果一定要提基因组DNA，那么用10的5次方就够了。

(3)从血液中提取DNA的常见问题: 在血液DNA的提取中，为什么用EDTA抗凝比用肝素抗凝要好？
高盐法与酚-抽提法对PCR的结果影响有什么不同？ 解答:

1.  EDTA可以破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，并且可以有效的抑制DNA酶的活力，而肝素的不能有效的抑制DNA酶的活力。
2. 酚-抽提法制备的DNA，产量高，纯度大，可用于限制酶切反应及测序。

3. 也有的实验者采用枸橼酸盐抗凝，但据一起做实验的人说，用EDTA抗凝和用肝素抗凝均可，因为有人用肝素抗凝也能做出结果来。至于高盐法与酚-抽提法对PCR的结果影响，对PCR结果并无太大影响，但苯酚，氯仿等有机试剂确实对Taq酶的活性有影响，盐析法的效率要高一些。国内也有人做过对比，认为两种方法提取的DNA纯度均可满足PCR要求，但盐析法的提取效率要高一些。

4.建议有凝血块时可以试一试用酚-抽提法，一般情况下采用高盐法就可以了.

(4)组织提取DNA的方法:

从动物组织提取基因组DNA
　　一、材料
　　哺乳动物新鲜组织。
　　二、设备
　　移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
　　三、试剂
　　1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
　　2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
　　四、操作步骤:
　　1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
　　2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
　　3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
　　4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37℃保温1-2小时, 直到组织完全解体。
　　5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。
　　6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。
　　7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
　　8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
　　9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。
　　10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。
　　11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。

(5)从植物组织提取基因组DNA
　　一、材料
　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。
　　二、设备
　　移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
　　三、试剂
　　1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
　　2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。
　　3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
　　4、 RnaseA母液：配方见第一章。
　　5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
　　四、操作步骤：
　　（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
　　1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
　　2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
　　3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
　　4. 室温下5000rpm离心5分钟。
　　5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
　　6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
　　7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
　　8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
　　10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
　　11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
　　12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
　　13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
　　[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
　　（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
　　1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
　　2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
　　3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
　　4. 同本节（一）中步骤3-13操作。

(6) 石蜡包埋组织的DNA提取
　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要， 结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法
从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。 首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所提行DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。
Goelz氏DNA提取方法的主要步骤
1.切除多余石错，暴露组织
2.将组织切碎（最大径<0.5mm），称重；
3.溶于TE9提取液(组织<50mg/5ml.50－500mg/10ml),高速混悬2－3min，于48℃放置24h
      ＴＥ９提取液的制备
           500mmol/L Tris
           20mmol/L EDTA
           10mmol/L NaCl
           1％ SDS
           500 μg/ml 蛋白酶Ｋ
           pH8.0
4.再次混悬组织，加入蛋白酶Ｋ至终浓度１mg/ml，SDS至２％，孵育40h；
5.用等体积酚－氯仿溶液抽提３次；
6.2.5倍体积乙醇沉淀DNA
7.-70℃放置２－４h
8.9 000xg离心１h
9.沉淀物用70％乙醇洗１次
10.干燥，TE（pＨ7.2）溶解。
　　不同类型的基因分析所要求的DNA质量和数量不同。Southern 印迹杂交分析需要10－15μg大片段DNA（>20kb），因为杂交前要进行相诮的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Slebos,et al,1990；Smit, et al, 1988 ）、 蛋白酶消化法（Impraimet al.1987；Brice,et al.1989）。
    这些方法不经过酚－氯仿－异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min 或在蛋白酶Ｋ缓冲液中消化４h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增， 但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且征对性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和与引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。
二、影响DNA提取质量的因素
1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Watford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆转羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白产K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。Barmwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel's运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量得明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker，Bs）处理标本不能获得完整的DNA。乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg，高于新鲜标本（19.4/mm3）。
经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特性卫星带，说明DNA被完全消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分量DNA完好无损。其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至－20℃过夜。然后再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2－3h，石蜡包埋。结果显示，每10mgAMex法处理的温重组织提得高分子量DNA71.4?4.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4?3.76μg）。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对开矿学、免疫表型和基因改变的相关分析。
2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生的，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定时是一个重要的变异因素。然而，Goelz等，没有发现固定时间对DNA提取量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8％。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30％，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应模索选定。根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110h之内。
3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节，其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接的互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90℃时，产生两条单链分子。最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构改变。当pH达到2.5惟下时，几乎所有碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N－糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最多，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而，既使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。
4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量晨100bp－10000bp之间，主要分布于100－1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关以外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短下一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的地间长短不一。虽然本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA弯性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。
三、提高DNA提取质量的方法
1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。因此，在DNA提取前应检查组织切片。如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。
2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们不同方面进行了探索。其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消地间的DNA纯化等问题上取得了进展。

①DNA提取液主要为含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DNA与蛋白质不易分离。因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：SDS可增至1％-2％，蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。Koshiba等尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2－巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2－羟基乙醇。应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得了高质量DNA。

②DNA释放率对于不同蝗组织类型是有差异的，最决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏），通过24h孵育80％以上DNA可释放出来；相同量的DNA释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间；转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质，DNA释放率亦为中等。由此可见，对不同类型的组织DNA提取，蛋白酶K的孵育时间可作适当调整，以求大量地获取大分子DNA。此外，对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。

③Dubeau等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的DNA，可通过搅起完整的DNA而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在DNA纯化中的重要性。该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的量，杂交分析显示，螺旋化DNA杂交信号强，而未螺旋化DNA信号减弱。因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。但是，Moerkert等认为未螺旋化DNA不影响进行点杂交分析。
3．免疫DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。经常的做法是将组织切在3－5μm薄片，使每一细胞都被切开但是，我们认为切片太薄，容易对过多地将DNA切断，影响高分子DNA的获得率。最好是采用15－20μm的厚切片，高浓度蛋白酶K消2－4天，使能达到细胞充分破碎、蛋白肖化的目的。并尽可能避免机械性匀浆过程造成的DNA剪切。此外，在DNA释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。若必需移管时应选用大口吸管。尽可能避免人为的DNA剪切。纯化DNA用TE（pH8.0）溶解放4℃保存即可，若短其不用时应-20℃冻存，但切忌反复冻融，以免DNA降解。