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DNA的提取的原理和方法
为了研究 DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取 DNA.由于 DNA分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适当的材料提取 DNA。
* 动植物中,小牛胸腺۰动物肝脏۰鱼类精子,植物种子的胚中都含有丰富的 DNA。
* 微生物中,谷氨酸菌体含7%~10%,面包酵母含4%,啤酒酵母含6%,大肠肝菌含9%~10%。
* 从各种材料中提取 DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。
* 对于低等生物。如从病毒中提取 DNA 比较容易,多数病毒 DNA 分子量较小,提取时易保持其结构完整性。
* 从细菌及高等动植物中提取 DNA难度大一些。细菌 DNA 分子量较大,一般达2×10 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌 DNA,除核 DNA 外,还有质粒 DNA 等。
1、 核酸的理化性质
A. RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶, DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
B. DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中, DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
C.天然状态的 DNA 是以脱氧核糖核 蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。要从 细胞中提取 DNA 时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去 细胞中的糖,RNA 及无机离子等,从中分离 DNA 。
2.细胞的破碎
①机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;
由于高等动物 DNA 主要存在于 细胞核与线粒体中,所以提取时有两个困难(高等植物与此类似):
①破碎 细胞难;从处死动物٠分离组织器宫到破碎 细胞费时长。在此时期间 DNA 可能会被DN ase降解,而动物组织:特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器,易造成 DNA 断裂。
②分子量大,一般比细菌的大2—3个数量级,比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料,要根据具体情况选择适当的分离提取方法。
(1).浓盐法
A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤 细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖 蛋白,再按氯仿---异醇法除去 蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
C.以稀盐酸溶液提取 DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于 蛋白质与 DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对 DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取 DNA.
(2).阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使 蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取 DNA .由于 细胞中 DNA与 蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取 DNA.
(3).苯酚抽提法:
苯酚作为 蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于 蛋白与 DNA 联结键已断, 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相,而 DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含 DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀 DNA 。此时 DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的 DNA保持天然状态 .
( 4).水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织 细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使 DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得 DNA样品.此法提取的 DNA中 蛋白质含量较高,故一般不用.为除 蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS. |