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PYRO测序用于SNP基因分型
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2008-08-02|  字体: [ ]  

其实是一种段片段焦磷酸测序技术,在测序引物的引导下,完成段片段(含snp)的测序,从而实现基因分型。缺点:不能检测长片段,对于重复序列没有办法。

原理简介

1.测序引物与单链,PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶,以及底物APS和荧光素一起孵育。

2.四种dNTP之一被加入反应体系,如与模扳配对,此dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。

3.ATP sulfurylase在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP,ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化,oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

4.TP和未掺入的dNTP由Apyrase降解,淬灭光信号,并再生反应体系。

5.然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序,即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是,在体系中使用的是dATPS而非dATP,因为dATPS不是荧光素酶的底物,而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。而且在系统之中,底物的浓度已经最佳化,使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度,ATP的合成速度快于水解速度,其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度,可以保证降解完全,使系统复原。


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