克隆中载体的处理和去磷酸化

克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：?

(2)如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；?

 (3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用

去磷酸方法如下： 

①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100pmol 5?磷酸基团加入1个单位的CIP，37℃反应30分钟。平末端或3端突出的 DNA，每2pmol 5?磷酸基团加1个单位CIP，37℃保温15分钟后，再加CIP，55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷酸基团)；

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度05%、 5mmol/L和50μg/ml，混匀后56℃反应30分钟；或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L，65℃保温1小时或75℃，10分钟灭活CIP;?

③冷却至室温后，加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;?10 mmol/L ZnCl?210 mmol/L MgCl 2100 mmol/L Tris·HCl,pH8.0。