启动子时往往有接头非特异产物产生，特异性较低，特异产物需杂交确定。由于利用接头的PCR法不需要DNA环化，通常适用于寻找已知cDNA周围未知启动子或其它调控区域。

　　YADE法在利用接头PCR时，巧妙地设计了“Y”型接头，从而有效地防止接头引物的单引物扩增，延伸时起始片段可以是基因组DNA也可以是cDNA．可用于复杂的基因组的PCR步行，能广泛应用于真核生物；其缺点是成本较高，在应用YADE法时，为了得到合适的内切酶，需要从众多的内切酶中筛选，另外，特殊的接头往往也增加了实验的成本。通常对于较复杂的真核生物基因组可以采用YADE法。

　　目前理想的启动子克隆方法需要更为广泛的，不需要PCR前的酶切、环化等操作，且特异性较高的PCR技术，TAIL-PCR基本符合这一条件。TAIL-PCR法的有以下优点：(1)方法简单，只要设计好引物，即可用基因组DNA为模板直接进行PCR扩增；(2)特异性高，用简并引物和特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应，使最终的目的片段占绝对优势；(3)高效灵敏，使用任何一个AD引物，在60％～80％的反应中能产生特异性产物；(4)快速，整个反应可在ld内完成，(5)避免了DNA的环化和连接，反应产物准确可靠，重复性好。TAIL～PCR的创新之处在于其热不对称的分级反应，有效防止了非特异产物的扩增；但是TAIL～PCR仍有很多不尽人意的地方：TAIL～PCR反应需要较多的引物组合；此外，由于随机简并引物存在有限的结合位点，对个别侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果，整个反应需要一系列连续反应，条件设置要求精细；还要求引物和模板有较高的纯度，如果有降解或纯度不够，也很难扩增出特异性条带；此外，TAlL～PCR还很有可能扩增的是高度重复序列，因而无法步行。TAIL～PCR技术适合于分离获得克隆载体上的DNA序列，达到克隆相关基因的启动子的目的，也可用于基因组小的物种，如拟南芥和基因组大的物种，如小麦的已知序列两侧翼的DNA序列的分离。

　　3　展望

　　目前，启动子克隆的方法种类繁多，进展迅速。启动子克隆方法绝大多数是建立在PCR的基础上的染色体步行技术，因而利用启动子克隆的方法不仅可以克隆到基因的启动子，同时还可以用于克隆cDNA的全长。分子生物学的一个重要问题是如何利用大量积累的基因部分序列(如EST)进一步克隆全长基因及其调控序列，而启动子克隆方法为这一问题提供了简便有效的手段。另外，随着基因工程的发展，出现了越来越多的转基因动植物，启动子克隆的方法也可以应用在转基因生物的研究中，如转基因水稻的T－DNA区，通过启动子克隆方法的PCR步行技术，能成功地克隆到T－DNA区的旁侧序列，有助于分析突变体中突变区序列。

　　随着PCR技术的不断进步，一定会有更多、更好的克隆启动子的方法产生，而它们最后也将会是克隆基因全长或突变体(特别是转座子插入突变体)中目的基因的简便高效的新方法。　　

    注：
    （1）参考文献：略；需者可与本站Email联系，或到中国水稻研究所图书馆查阅；
    （2）文章来源：中国生物工程杂志，2005年25卷第7期；
    （3）作者单位：黑龙江大学生命科学学院 等。