PCR，将3轮的PCR产物进行电泳分析结果表明，采用TAIL-PCR的方法成功地从突变体中获得了带有T-DNA左右边界的旁侧序列，从而证明了TAIL-PCR法是有效地扩增基因旁侧序列的方法，为启动子的克隆又增添了1种可行的方法。

　　TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了环化和连接，速度快，特异性强，效率高，灵敏，在分子生物学研究的各个领域都有广泛的应用。

　　2　讨论

　　以上介绍的几种方法基本代表了现有的启动子克隆方法，它们分别具有不同的特点和适用范围。

　　利用启动子探针载体筛选启动子时，不需要知道具体的基因序列，避免了引物设计，并能获得大量的启动子片段；其缺点是需要构建1个穿梭质粒，建库、转化、筛选，工作量大，费时费力，而且克隆、亚克隆的过程繁琐。因此在基因的遗传背景不是很清楚时，往往通过探针载体随机筛选启动子。

　　而PCR法的主要优点是简便、快捷、操作简单；其缺点是只能扩增两端已知序列间的DNA区，且扩增的特异性较低。其适用条件是建立在对基因序列十分清楚的基础上，只有知道基因的全序列，才可根据已知序列设计引物,扩增出该基因的启动子。因此，在基因序列清楚的情况下．我们首先想到的就是PCR法。

　　I-PCR法操作简单，克服了文库筛选、克隆、亚克隆的繁琐步骤，对实验条件要求不高，花费少，在PCR法的基础上，增加了DNA的环化过程，从而可以扩增只有一端序列已知的DNA，由于不需要设计和合成大量昂贵的核苷酸接头，因此避免了引物设计和有接头而产生的非特异性产物的麻烦；然而由于直接克隆已知序列外的未知DNA区域依赖于DNA的环化性，而环化连接过程中常常产生多联体，成为副产物甚至是主要产物，导致非特异扩增，造成了闭环双链的DNA的PCR扩增效率差，经常得不到满意的结果，同时酶切片段太长也会使扩增效率下降。其适用于寻找只有一端序列已知的DNA,对未知DNA片段进行扩增。

　　相对于I-PCR，P-PCR经过设计形成的是锅柄状单链DNA模板，从而有效增加了引物与模板结合的特异性，p-PCR能够完成全部嵌套式扩增，因而产物有非常高的特异性；其缺点是也存在DNA环化、连接的弊端，但与I-PCR相比，其PCR产物的特异性已大大增加。目前，P-PCR可以扩增位于已知位点侧翼的大于3.0kb的人基因组DNA的启动子，是目前为止能扩增距离已知序列最远的DNA序列的方法．因而常用于扩增大片段的未知序列。

　　利用载体的PCR克隆启动子有实验设计简便的优点，在基因组DNA中加入含合适酶切位点的载体，是基于PCR法的又一创新之处；然而其实验操作较为繁琐，特异性差，即使用套式PCR，仍然有几条电泳条带，因而特异性产物需杂交进一步确定。

　　利用接头的PCR克隆启动子的优点是避免了DNA环化，改进的接头可以通过形成锅柄结构有效抑制非特异性序列的扩增，但设计和合成大量的核苷酸接头，价格昂贵；此外用常规的加接头的方法来克隆