大片段DNA的琼脂糖凝胶回收

大片段：指的是片段大小超过10kb的DNA片断，由于越长的DNA分子和纯化膜的结合力越强，洗脱力越差，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离心过柱的方法并不适合大片段DNA的回收。在凝胶电泳的大片断回收，特别是几十kb的大片断，经典方法是电洗脱。此外，低熔点琼脂糖和琼脂糖酶消化也是常常有人选用的方法，新兴的方法是用玻璃奶或者纯化填料。其实无论用什么方法，在回收大片断时一定要牢记你对付的是大片断，操作时一定要小心注意，粗暴的操作，最后结果也是自己来承受的。

    这些方法中，速度最快的就是玻璃奶或者纯化填料珠的试剂盒了。毕竟，谁愿意为一个小小的胶回收浪费2个多小时呢？有那功夫干点别的不好？我最早用的其实是当时的Pharmacia（后来改为Amersham，现在是GE Healthcare Life Sciences）的一个玻璃奶（Glassmilk）试剂盒。现在记得Glassmilk的人应该不多了，在当时却是我们眼中的神奇宝贝——半个多小时就可以完成本来要搞2个多小时的活：溶胶液溶胶后，加入10ul混匀的玻璃奶溶液，混匀静置吸附后，离心去上清，再清洗1—2次，干燥，最后用洗脱液洗脱，离心取上清即可。

1.QIAEX II

产地：Qiagen
回收范围：40bp-50kb

特点：

• 通用性高：一般或者低熔点琼脂糖凝胶，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝胶
• 无NaI干扰后续实验
• 大片段DNA保存较好，不会被剪切

使用心得：

    这个试剂盒不同于Qiagen其它的胶回收试剂盒，利用的是配合高离液盐（chaotropic salt）的silica-gel particles，因此QiaEX可以从盐，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，染料，蛋白以及核苷酸中无需苯酚抽提或者酒精沉淀即可获得纯化DNA片段。这个试剂盒使用方法和玻璃奶的试剂盒基本一样，区别在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、边缘尖锐等情况，在离心力下，大小不同的碎片的沉降系数不同而导致在沉淀中分布位置不同，当长片断一头粘附在大片断一头吸附在小片断上，离心产生的剪切力就会导致长片断的断裂。而QiaEX的纯化填料是人工特制的大小均一的球形小珠（Beads），能更好的吸附DNA，也不易产生上述的剪切力问题，使得回收的大片断DNA更为完整。

    无论是玻璃奶还是纯化填料，比起过柱的方法，优点在于适用于较大范围的DNA回收，从小片断到超级大片断都可以，适用范围广；而且每次反应可以根据估算的待回收DNA的量来放大或者缩小纯化试剂的量，比较灵活。比如QIAEX说是150反应（每次5ug），实际上往往可以用200多次或者更多。

    但是这个方法的问题有2个，一个是比较麻烦，需要一定操作经验——无论是清洗或者是最后的洗脱，离心后要尽量多取上清而不干扰沉淀，多少有点点难度，特别是最后取洗脱的DNA，要舍得放弃最后那点上清，免得回收产物中混入了纯化介质，在后面的实验中得不偿失。所以，你可以从此想象，由于每次离心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的，去除始终不彻底，这就注定了这个方法纯化的产物纯度不如离心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX说这个回收产物可用于酶切、连接、标记和PCR，但是就没有提到显微注射芯片分析等更高要求的实验。另一个问题是干燥的程度如何把握需要一定经验——干过头了洗脱困难，没干透就会将酒精带入后继实验——要干到沙面雪白而靠管壁的最边缘还有丁点透明就可以了。当然，这个现象描述起来不着边际，做过的人就心中了了。洗脱体积通常是20ul。操作要领除了前面提到的问题，就是离心充分，离心后取管子动作轻快，事前调好加样枪，取上清要轻，靠壁、放枪缓，动作利索，不要千万不要来回抽。舍得放弃。

QiaEX相关参数：

    类似方法的产品还包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit

2 Agarose Gel DNA Extraction Kit
产地：Roche-Applied Science
回收范围：0.4kb—100kb(单核苷酸〉20bp）

特点：

• 标准的或低熔点琼脂糖回收都可
• 可以用于克隆连接或者高特异性标记（基本标记或缺口平移primed labelling or nick translation）
• 0.4kb—9.5kb范围内回收率为80%
• 通用型试剂盒：大至100kbDNA片段到小到寡核苷酸都可以
• 操作简单
• 均匀统一的纯化介质珠，减少剪切力，无杂质（比如酶抑制剂），不会影响后续反应

使用心得：

    Roche的胶回收试剂盒原理也是一样的，可以完成几乎实验室有关DNA胶回收的所有需要，从基因组大片段DNA到单核苷酸，并且在回收率上也有出彩的表现：0.4-9.5kb，大约80%；10-100kb，大约60%；单核苷酸（>20碱基），大约65%

    其实，纯化介质在使用中有一些操作的问题，其实改良起来也并不很困难。只要多提供一个单纯过滤离心柱，原来的问题看来应该不难解决——直接将混合有纯化介质的溶胶液加入柱子中过滤离心，吸附了DNA的纯化介质在膜上，上清彻底离心到管中，不就不用担心会悬浮沉淀、干沙等等问题了吗？其实Promega就有这样的解决方法，不过由于那试剂盒主要目的是纯化PCR产物或者酶切反应中的DNA，本身不带溶胶液，所以在这里就不具体介绍了。

    这种方法通常需时半小时左右，算是比较快速省事的。毕竟大片断的操作要格外小心。这里再重复介绍一下其他的一些方法。

    1. 低熔点琼脂糖：如果你手头有Cambrex（原来的FMC，琼脂糖行业标准的制定者）的SeaPlaque GTG琼脂糖，那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上第一个低熔点琼脂糖系列，Cambrex的GTG（遗传技术级别）级琼脂糖特别去除了抑制酶反应的各种杂质，可以在琼脂糖凝胶中进行各种酶切、连接、PCR、转化等等实验。所以，SeaPlaque GTG凝胶电泳后切下的条带就可以在65度融化（20-30度凝固），直接进行后继的酶切连接PCR等等的反应了，当然，前提是你的电泳槽和Buffer要足够干净，最好是专用的。这个反应条件实在是足够温和，当然不便宜，25克琼脂糖要1788大元!特别适合分辨200bp—25kb的片断。其实，也就是大小通用的方法。

    如果只是普通的低熔点琼脂糖也不要紧，切下来的胶块加入缓冲液65度融化后冷却到室温，可以直接用等体积酚抽，也可以用琼脂糖酶来消化。酚抽时注意不要剧烈振荡以免损伤大片断DNA，两相间的白色物质是琼脂糖，取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。琼脂糖酶可以消化融化的琼脂糖为低聚糖，随后用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的这种酶50单位价格300多，每200mg 1%凝胶用一个单位酶，42度条件下反应。Takara的这种酶100单位260多，同样体积的凝胶要用2个单位，可以在60度反应，所以也可以用常规琼脂糖。只是常规琼脂糖在65度挺难融，很费时间。

    2. 电洗脱的原理是将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相，回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。电洗脱主要的麻烦是在透析带都比较大、两头要绑，没有刚性的袋子使用不方便，中间溶液体积大，膜面积大容易吸附产物。以色列一家公司出品的GeBA产品，是在离心指管两边开窗贴上透析膜，这种管子可用于透析或者电洗脱，由于管子有刚性，内容体积固定，膜面积也很小，同时还提供电洗脱时放在电泳槽中的架子，操作起来十分方便，很大程度上解决了这个困扰。电洗脱条件温和，对琼脂糖没有特殊要求，同时还可以用于丙烯酰胺凝胶中的片断回收或者是蛋白质的回收。GeBA的产品基因有限公司有售，此外Merck旗下的Novagen也引进了类似的产品，价格相当。

    3. 挖槽法。限于个人习惯的一些不入流的小技巧，有时应急（比如定的产品老不到货时）也可以对付一下。无非就是在条带前面挖坑，加入缓冲液，继续电泳半分钟，手提紫外观察，等条带全“下海”就把坑里的溶液都吸上来。大片断会遇到的问题通常是出胶慢，上对岸倒快，所以应对就要用2手，一个是在坑里缓冲液中加点什么让泳动速度降下来（低熔点琼脂糖就是其中一个方法），要不就在对岸堵上孔径特小的膜，等这边条带全部下水后反向电泳一下，让被膜阻挡的DNA回头，离开那膜。然后取溶液纯化DNA。这些方法通常在条带浓，回收率要求不高的时候可以应急，挺磨耐性的，平常还是用Kit的算了。这里提到的老方法，都要特别注意，切胶的刀要干净锋利，切口平滑，切得不整齐有时DNA出胶很慢，不知道为什么。